A aspartil aminopeptidase APE4 envolvida em autofagia é importante para o crescimento a 37°C em Cryptococcus neoformans.

Fabiano de Assis Gontijo

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Abstract

Cryptococcus neoformans is an opportunistic fungal pathogen of humans that primarily infects immunocompromised patients. When left untreated, the disease can cause risk of death, and because of similarities between fungal and animal cells, the antifungal compounds often result in toxicity to the host, so many fungal infections are often difficult to treat. This restriction leads researchers to explore new targets for drugs aimed virulence factors, such as ability to grow at mammalian physiological temperature (37°C). In order to expand the knowledge about the biology of the fungus, a random insertion mutagenesis library created using the gene delivery system mediated by Agrobacterium tumefaciens, was analyzed seeking the mutants with impaired growth at 37°C. Among the various sensitive mutants at 37°C, identified a mutant that showed an interruption of the gene encoding the aspartyl aminopeptidase protein (APE4). In Saccharomyce cerevisiae, the M18 metalloprotease Ape4 is activated by deprivation of nitrogen and its proteolytic activity is specific front of aspartate and glutamate amino acids located in the amino terminal portion of the protein. This protein is involved in autophagy, and also part of the cytoplasm to vacuole pathway (CVT). Are part of the CVT Ams1, Ape1, Ape4 Atg11 and Atg19 proteins. In nitrogen starved conditions the protein ape4 is located inside the vacuoles. The lack of ape4 protein in S. cerevisiae did not lead to high sensitivity to growth temperature. Moreover, it was demonstrated that C. neoformans ape4 mutant does not grow at 37°C as well as defective in other important virulence factors, such as phospholipase production, the formation of the capsule and the ability to survive within macrophages (J774A .1). Similarly to S. cerevisiae, the labeled protein Ape4 of C. neoformans (Ape4::GFP) was co-located within the vacuole during the nitrogen privation. Quantitative PCR analysis showed that expression of the gene APE4 during growth conditions at 37°C is modulated by the absence of nitrogen source.

Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico oportunista de seres humanos que infecta principalmente pacientes imunocomprometidos. Quando não tratada, a doença pode causar risco de morte, e devido a semelhanças entre células fúngicas e animais, os compostos antifúngicos geralmente resultam em toxicidade para o hospedeiro, por isso, muitas micoses são muitas vezes difíceis de tratar. Esta restrição leva investigadores a explorar novos alvos de drogas que visam factores de virulência, tais como a capacidade de crescer à temperatura fisiológica dos mamíferos (37°C). Com o intuito de expandir o conhecimento sobre a biologia do fungo, uma biblioteca aleatória de mutagénese de inserção, criada utilizando o sistema de entrega de genes intermediado por Agrobacterium tumefaciens, foi analisada buscando os mutantes com comprometimento do crescimento a 37°C. Entre os vários mutantes sensiveis a temperatura de 37°C, identificamos um mutante que apresentava uma interrupção do gene que codifica a proteína aspartil aminopeptidase (APE4). Em Saccharomyce cerevisiae, a M18 metaloprotease Ape4 é ativada pela privação de nitrogênio e a sua atividade proteolítica é especifica frente aos aminoácidos aspartato e glutamato localizados na porção amino terminal da proteína. Esta proteína está envolvida na autofagia, e também faz parte da via de transporte do citoplasma para o vacúolo (CVT). Fazem parte da CVT as proteínas AMS1, Ape1, Ape4 Atg11 e Atg19. Em condições de privação de nitrogênio a proteína ape4 é localizada no interior dos vacúolos. A falta da proteína ape4 em S. cerevisiae não conduz a sensibilidade crescimento à alta temperatura. Por outro lado, foi demonstrado que o mutante ape4 em C. neoformans não cresce a 37°C além de apresentar defeito em outros importantes fatores de virulência, tais como a produção de fosfolipase, formação da cápsula e a capacidade de sobreviver dentro de macrófagos (J774A.1). Da mesma forma que em S. cerevisiae, a proteína Ape4 marcada de C. neoformans (GFP::Ape4) foi co-localizada dentro dos vacúolos durante a privação de nitrogênio. A análise quantitativa por PCR mostrou que a expressão do gene APE4, durante as condições de crescimento a 37°C, é modulada pela ausência da fonte de nitrogênio.